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本产品是一种快速高效的高产膜蛋白提取试剂盒。适用于从动物细胞和动物组织提取总膜蛋白。提取过程简单方便，可在1小时内完成。提取的膜蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。

本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细胞膜组份，包括细胞质膜、核膜和各种细胞器膜。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒的蛋白提取组份中不含有不可透析除去的去垢剂组份，不含SDS、Triton X-100、chaps等可能影响质谱实验的组份，基本可以满足下游任意的蛋白质组学相关实验研究。

本产品的蛋白酶抑制剂混合物中不含AEBSF，可以避免由于AEBSF导致的质谱峰漂移，因此使用本产品提取的蛋白样品可以用于质谱(Mass Spectrometry,MS)检测和分析，蛋白质组学(proteomics)等相关研究。

本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白也可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

• 使用方便，从细胞，组织提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 将蛋白提取的时间缩短至1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

• 提取液制备：
  每500μL冷胞浆蛋白提取液A加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  每500μL膜蛋白溶解液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  ● 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
  
• 取5～10×10⁶个细胞，在4℃，500×g条件下离心3～5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
  注：
  ● 贴壁细胞可以从培养器皿上消化下来或者用一次性细胞刮刀刮下来后处理，也可以直接原位裂解处理。
  ● 原位处理时先小心吸取贴壁细胞的培养液，用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干PBS。加入适量冷的蛋白提取液A，4℃振荡20～30分钟，至细胞充分裂解，用细胞刮刀刮一遍，将裂解液吸入另一干净离心管。
  ● 原位裂解时推荐提取液A使用量：60mm培养皿250μL～500μL；100mm培养皿500μL～1mL；6孔板200～250μL/孔；24孔板100μL/孔；96孔板50μL/孔；75cm2培养瓶500μL～1mL。
  ● 如果是组织样本，取50mg～100mg组织样本，用冷PBS洗干净，然后用手术剪刀尽可能剪碎，加400μL冷的试剂A，用组织匀浆机/器匀浆至无明显肉眼可见固体。如果组织样品很细小，可以剪碎后直接加入提取液振荡20～30分钟，可以不用匀浆器。一般按组织：提取液用量1：5（w/v）左右加入提取液即可。将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃条件下振荡20～30分钟。按照细胞蛋白的提取方法的第5步骤往下操作即可。
  
• 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  注：
  ● 2000×g，离心3～5分钟。
  
• 细胞样品中加入200μL～400μL冷的试剂A，充分混匀。
  注：
  ● 细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
  ● 由于膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率。在条件允许的情况下，尽可能加大细胞上样量。
  
• 在2～8℃条件下振荡20～30分钟，至细胞充分裂解，细胞沉淀明显减少。
  注：
  ● 此步骤必须在2～8℃条件振荡。
  ● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
  ● 没有2～8℃振荡条件也可以不振荡，置2～8℃静置，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
  ● 此步如果细胞裂解不充分，下步有大量细胞沉淀，请延长2～8℃振荡裂解时间至40分钟或更长，直至细胞充分裂解。
  
• 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
  
• 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴10分钟。
  
• 在37℃，1000×g离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为30～50μL。
  注：
  ● 此步骤必须在37℃条件下离心。
  ● 没有37℃离心条件也可以不离心，稍微延长37℃水浴时间，至液体澄清，分层清晰。
  ● 下层膜蛋白部分为粘稠状液体。
  
• 小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。
  注：
  ● 上层部分为细胞胞浆蛋白。
  ● 待下游目的膜蛋白实验完成后再丢弃此部分。膜蛋白萃取不完全时此部分蛋白仍可进行再次提取膜蛋白。
  ● 进行下游实验时，可用试剂C分别稀释上层和下层，取一个上层样品同时进行实验分析。
  
• 用500μL冷的试剂C膜蛋白溶解液溶解下层膜蛋白部分，即得膜蛋白粗提液。
  
• 取5mL离心管，加入500μL膜蛋白粗提液，加入2mL试剂E，500μL试剂F，1.5mL试剂G，涡旋20秒充分混匀。
  
• 冰浴或4℃冰箱静置30分钟以上。
  
• 在4℃，11000×g条件下离心15分钟。
  
• 小心移除上层清液丢弃，收集中下层蛋白层。
  
• 在4℃，14000×g以上条件下离心15分钟。
  
• 小心移除上清，留沉淀。
  
• 在超净台将沉淀晾干。
  
• 根据下游实验需要，用相应缓冲液40～200μL溶解沉淀。
  
• 在4℃，14000×g条件下离心10分钟。
  
• 收集上清用于下游实验。